體外細胞毒性試驗

飛凡檢測可依據(jù)GB/T 16886.5進行體外細胞毒性試驗測試，報告具有CMA/CNAS資質(zhì)全球認可。咨詢熱線：18018131362

        試驗步驟：

基本步驟

L929細胞接種到96孔板上，在培養(yǎng)中保持24小時(1倍周期) ，直到形成一個半收斂的單分子層(見參考文獻。[5]了解更多有關(guān)細胞維持和培養(yǎng)程序的資料)。然后與一系列濃度測試化合物接觸。暴露24小時后，測定各實驗濃度，并與對照細胞比較。每個試驗濃度計算生長抑制百分率。

材料:L929細胞(NCTC克隆929:CCL1 1，美國類型培養(yǎng)物保藏中心[ATCC]，美國弗吉尼亞州馬納卡斯)用作細胞系。ECACC編號88102702，歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心，SP40JG，薩爾茨堡，英國)，并且細胞培養(yǎng)物應(yīng)不含支原體。

準備：

培養(yǎng)基，

MTT法溶液：MTT溶液進行新鮮知識溶于其中不含酚紅的MEM中，濃度為1mg/ml。溶液可以采用這種注射壓力過濾器，經(jīng)無菌過濾法除菌，溶液宜當天我們使用。

樣品提取物的制備: 按 iso 10993-12標準制備樣品提取物

方法：

檢驗質(zhì)量檢驗1:陽性對照和陰性對照

試驗質(zhì)量檢查2：空白

試驗步驟：

注意：貯存細胞進行解凍后，細胞在用于臨床試驗研究之前要傳代2次~3次

在凍存細胞繼代培養(yǎng)后的第一天

酶驅(qū)動的消化（trypsin/EDTA）用于從培養(yǎng)瓶中取出培養(yǎng)細胞，細胞懸浮在200克離心3分鐘。       咨詢熱線：18018131362

細胞密度調(diào)整至1105細胞/毫升。用多通道移液管在96孔組織培養(yǎng)微板的孔中外側(cè)加入100l 培養(yǎng)基。[附錄 e ]) ，在剩余的孔中中，加入100l 細胞懸液，密度為1105細胞/ml (= 1104細胞/孔)。細胞培養(yǎng)24小時(5% co2,37 ° c，> 90% 濕度)形成半融合單層。在這個疾病潛伏期期間，細胞被修復(fù)并附著在指數(shù)增長上。在相差顯微鏡下檢查每個平板，確保微滴定板的孔細胞長度相等。這個測試的目的是確定實驗誤差

第2天

孵育24小時后，向每個孔中加入100微升含有適當濃度樣品提取物、陰性對照、陽性對照或溶劑(空白)的處理介質(zhì)。試驗或陽性對照的浸出液應(yīng)至少有4個濃度，最高濃度應(yīng)為100%浸出液，其他濃度可在單對數(shù)區(qū)間范圍內(nèi)適當濃縮。陰性對照應(yīng)僅檢測100%提取物，培養(yǎng)基應(yīng)作為空白。細胞培養(yǎng)24小時(5% CO2，37℃，濕度> 90%)

第3天

24h處置后在相差顯微鏡下檢查我們每個板，判定以及細胞進行接種管理系統(tǒng)設(shè)計誤差和對照與試驗組細胞的生長環(huán)境特性。記錄分析試驗研究樣品浸提液細胞產(chǎn)生毒性影響作用從而導致的細胞通過形態(tài)學處理方面的改變，但這些數(shù)據(jù)記錄不用于其他任何組織細胞具有毒性定量方法測定。對照細胞的不良社會生長發(fā)展特性可表明實驗操作誤差，并且企業(yè)可能會出現(xiàn)因此沒有放棄該試驗采用平板檢查后小心移除培養(yǎng)基，這是作為一個非常重要工作步驟，因為浸提液中的化學還原劑也會還原MTT，導致假陰性預(yù)測結(jié)果。將50μLMTT溶液（見C.2.2.4.3）加到每一試驗孔中，平板在37℃培養(yǎng)箱中再孵育2h。然后棄去MTT溶液，每孔加入100滴定板光度計上測定吸光度（參照波長650nm）。A1異丙醇溶液。震蕩平板，置于配置570nm濾光片的微孔

數(shù)據(jù)分析

活細胞數(shù)減少從而導致了樣品中代謝功能活性可以降低，這直接與生成的藍紫色甲臢量有關(guān)，在570nm測量光密度。按式（C.1）與空白等式問題比較分析計算企業(yè)存活率明顯下降

100×OD存活率(%)

ODs——試驗研究樣品100％浸提液光密度分析平均值；

平均OD5空白光密度

當存活率低時，測試樣品的潛在細胞毒性高

如果細胞存活率降低到空白細胞的70% 以下，則存在潛在的細胞毒性。試驗樣品50% 提取物的成活率應(yīng)至少與100% 提取物相同或更高，否則應(yīng)重復(fù)試驗。

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