基因技術(shù)服務(wù)
飛凡標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)(蘇州)有限公司
一代測序原理
Frederick Sanger 是一位1918年出生于美國的生物化學(xué)家,曾經(jīng)兩度獲得諾貝爾化學(xué)獎 。上世紀(jì)70年代末,他提出快速測定脫氧核糖核酸(DNA)序列的技術(shù)“雙脫氧終止法”,也被稱作“Sanger法”。
早在2001年完成的人類基因組框圖,采用的就是該方法。而且因準(zhǔn)確率高,直到今天還在廣泛使用,也被稱為基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。下面我們來看看Sanger法是怎樣測得基因序列的。
Sanger 測序法原理
構(gòu)建反應(yīng)系統(tǒng)
Sanger法測序由一套四個單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成,每個反應(yīng)系統(tǒng)包含
四種脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP),可以正常合成DNA
每個反應(yīng)系統(tǒng)加入四種不同的雙脫氧核苷三磷酸 (ddNTP),由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán),使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止,另外為了方便定位,需要用熒光或者同位素標(biāo)記。
目標(biāo)片段、DNA聚合酶、引物,反應(yīng)體系
這樣我們的四個反應(yīng)體系構(gòu)建完成 (四種顏色分別代表不同的 ddNTP 反應(yīng)體系):
擴(kuò)增目的片段
下一步進(jìn)行擴(kuò)增,以目的片段為模板,在DNA聚合酶的催化下,從引物處起始開始復(fù)制DNA,當(dāng)遇到ddNTP,反應(yīng)停止。
由于反應(yīng)體系中 dNTP 與 ddNTP 相對濃度的調(diào)節(jié),使反應(yīng)擴(kuò)增得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。這里是ddNTP與dNTP在復(fù)制過程中結(jié)合到延長鏈上的幾率,如果ddNTP濃度高,結(jié)合幾率高,阻礙鏈延長的幾率就高,那么目的片段復(fù)制的長度就短。
也就是說,這些擴(kuò)增產(chǎn)物具有共同的起始點(diǎn),但終止在不同的的核苷酸上。
比如,下圖的復(fù)制過程中遇到帶尾巴的黃色核苷酸,一共復(fù)制9個堿基。
序列讀取
最后通電開始跑條帶,在電流與凝膠阻力的作用下,縱向會出現(xiàn)具有相同間隔有規(guī)律的條帶,它代表著不同的序列長度,在橫向分別對應(yīng)ATGC。現(xiàn)在,我們很容易就可以讀出下圖的DNA片段序列為 5’-GATTCGAGCTGA-3’。
現(xiàn)在推斷模板鏈(也就是待測片段)為 3’-CTAAGCTCGACT-5’
隨著物理及化學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們想到可以用相同的激發(fā)波長且具有不同發(fā)射波長的熒光基團(tuán)標(biāo)記 ddNTP(用一種激發(fā)光照射后,這些基團(tuán)會有不同的光學(xué)顏色)。現(xiàn)在,我們就可以把四種 ddNTP 放在同一體系下,通過光激發(fā)將四種光波長信號轉(zhuǎn)化為電腦可識別的電信號,在計算機(jī)眼里就會表現(xiàn)為不同的物質(zhì)來處理。
這些新技術(shù)的加入使我們進(jìn)入測序2.0時代,商用的二代測序是目前主流的測序技術(shù),它以高度自動化測序儀為載體,實現(xiàn)了測序速度的提高,通量的升高,測序成本的減低,但是同時也會降低準(zhǔn)確率。
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